行星式球磨研究涂料中納米粒子的毒性（一）

涂料中的納米顆粒與原生納米顆粒在小鼠體內的毒性

納米材料*的物理和化學性質使得它在越來越多的工業應用中被使用，漆料添加劑中也廣泛使用了納米材料。例如，二氧化鈦（TiO₂）工程納米顆粒（ENP）具有良好的抗UV，自清潔和空氣凈化效果。銀（Ag）ENPs以其抗微生物能力而聞名，二氧化硅（SiO₂）ENP用作阻燃劑和抗刮涂層。本研究比較了三種原始ENPs（TiO₂，Ag和SiO₂），實驗將含有ENPs（TiO₂，Ag和SiO₂）的三種老化涂料與不含ENPs的對照涂料的毒性效應和生物分布進行對比。用ENP或油漆顆粒（20μg/吸出）讓BALB / c小鼠口咽吸入，每周一次，持續5周，并在zui后抽吸治療后2或28天令其死亡。進行支氣管肺泡灌洗，評估全身血液毒性，并完成炎癥細胞誘導因子和關鍵的血液參數的細胞計數。此外，提取出肺，肝，腎，脾和心臟并測定金屬濃度。

原始ENPs在肺中引起的影響較小，在血液中引起的改變也可以忽略不計。在吸入含有Ag ENPs的氣體后觀察到的毒性作用zui顯著；測定了嗜中性粒細胞和促炎細胞因子分泌物（角化細胞化學引誘物（KC）和白細胞介素-1β（IL-1β））的量增加了兩倍以上。含有TiO₂ ENP的涂料不改變巨噬細胞和嗜中性粒細胞計數，但輕度誘導KC和IL-1β。含有Ag或SiO₂的涂料沒有顯示顯著的毒性。生物分布實驗顯示吸入Ag或SiO₂ ENPs后，Ag和Si在肺外的分布。總提來講，該研究證明即使直接暴露于ENPs環境下能夠誘導出一些毒性作用，但當他們被嵌入一個復雜的油漆基質后，期不良的毒理作用被大幅度降低甚至微乎其微。

工程納米粒子（ENPs）的當前應用覆蓋廣泛的工業和消費部門，包括化妝品，藥??物和材料科學。在結構領域，ENP可以改善重要的材料特性，例如提高強度和耐久性，同時降低總重量。 ENP還顯示出對材料添加有用的性質，包括熱，自清潔和防霧效果。 ENPs在木材，金屬，陶瓷，天然石材，混凝土，復合材料和塑料的新涂料和涂料體系的開發中也顯示了作為涂料添加劑的巨大潛力。在工業應用方面，涂料，涂料和顏料是ENPs在總體使用方面的zui重要的應用。

在油漆和涂料中使用的三種zui普遍的ENP是二氧化鈦（TiO₂），銀（Ag）和二氧化硅（SiO₂）。 2008年Mueller和Nowack的一項研究表明，在歐洲，35％的納米Ag生產和25％的納米TiO₂生產被涂料和涂料行業使用，使該行業成為納米Ag的*個終端用戶，納米TiO₂的第二終端用戶。納米TiO₂的光催化和疏水性質產生具有自清潔，空氣凈化和抗UV性能的涂層。納米Ag替代化學殺菌劑的抗菌效率，而添加納米二氧化硅將增加涂料和涂料的耐劃傷性和耐火性。目前在油漆和涂料中使用的其它ENP主要來源于具有自清潔和抗UV性能的氧化鋅（ZnO），以及以耐火性和高拉伸強度見長的碳納米管。

油漆和涂料中使用的ENP接觸可能在生產過程中或當涂覆涂層時發生。氣體吸入是zui可能的接觸途徑，特別是當涂料通過噴涂應用通常在涂料工業中進行時。同時，材料的老化過程例如長時間暴露在UV環境中，熱應力作用，水損壞和劃痕或在砂磨、鉆孔過程中暴露在空氣中。此外，在空間狹小缺乏通風的室內，毒性物質的含量要比室外環境更高。

ENPs的毒性是過去幾年的主要研究焦點。但當它們嵌入復雜的涂料或涂料基質中后，人們對它們的毒性了解卻并不多。在本研究中，比較了三種原始ENPs（TiO2，Ag和SiO2），含有ENPs（TiO2，Ag和SiO2）的三種老化涂料與不含ENPs的對照涂料的炎癥和毒性作用。通過口咽吸入使小鼠肺部與有毒物質接觸。此外，通過電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）評估原始ENP和包含ENP的老化涂料對不同器官（肺，腎，脾，肝和心臟）造成的影響。我們的研究結果表明，雖然接觸原始ENPs確實能夠誘發毒性反應，但在油漆基質阻止了大多數顆粒的毒性傳遞。

材料和方法

材料

含有（TiO₂，Ag和SiO₂）ENPs的涂料和沒有ENPs的對照涂料由工業項目合作伙伴提供。

異氟烷（Forene）獲自Abbott Laboratories（SA Abbott NV，Ottignies，Belgium）。

戊巴比妥（Nembutal），來自SanofiSantéAnimale （CEVA，Brussels，Belgium）。

制造老化的粉末涂料顆粒

使用涂膜器將液體涂料施加在塑料板上，產生200μm厚的均勻膜。在室溫（20℃）下干燥24小時后，使用金屬刮刀手動除去油漆以獲得粉末涂料。這些粉末使用行星式球磨機研磨，zui后暴露于UV-A（Philips TL20W / 09N）500小時（64個亮度循環，光暗時間4h-4h ）式材料老化。

粒子表征

掃描電子顯微鏡

將老化的涂料粉末沉積在用自粘碳標簽（G3347N，Agar Scientific，Essex，UK）覆蓋的鋁柱上。在金濺射之后，通過掃描電子顯微鏡（SEM）（Jeol JSM-6610 LV，加速電壓：10kV，工作距離：10mm）表征涂料顆粒。

動態光散射

在ALV / CGS 3儀器（ALV，Langen，德國）上進行多角動態光散射（DLS）測量。為了避免任何可能的污染，用過濾的丙酮（450nm Chromafil PTFE過濾器）清潔毛細管，并在測量前在110℃下干燥。將樣品置于超聲浴中15分鐘，并在測量前插入5分鐘以允許溫度穩定。在30°至150°的散射角度下以15°的步長執行幾組60s的DLS測量，波長為632.8nm。這種多角度方法將允許校正由顆粒各向異性和/或多分散性導致的散射強度的角度依賴性。強度自相關函數的建模使用累積方法（如果適用）和用zui大熵方法進行交叉檢查。

ζ電位

ζ電位測量在ZetaPlus zeta電位分析儀上進行，用ZetaPALS選項擴展。 PALS（相位分析光散射）比基本ZetaPlus設置中使用的Doppler方法更靈敏。在DLS測量之后回收ζ電勢測量的樣品，并使用Smoluchowski模型分析獲得的結果。

老鼠

雄性BALB / c OlaHsd小鼠（6周齡）。將小鼠飼養在具有12-h暗/光循環的常規動物房中。將它們容納在過濾器頂籠中并且隨意接受輕微酸化的水和顆粒狀食物。所有實驗程序由當地動物實驗倫理委員會批準。

實驗方案

在第0,7,14,21和28天，在光異氟烷麻醉下接受原始ENP的口咽吸入（25μl），含有ENP的老化的涂料顆粒，控制老化的涂料顆粒（0.8mg / ml）或賦形劑鹽水（0.9％NaCl））。在zui終抽吸治療（第30天）后2天通過腹膜內注射戊巴比妥（90mg / kg體重）處死小鼠。暴露于原始ENP或載體的第二組小鼠在zui終抽吸治療（第56天）后28天處死。實驗方案的示意圖如圖1所示。

圖1：實驗設計示意圖。

 在第0,7,14,21和28天通過在異氟醚麻醉下口咽吸入將小鼠暴露于不同的顆粒。

在第30或56天進行尸體解剖。

肺部炎癥（支氣管肺泡灌洗）

在用0.4ml無菌鹽水（0.9％NaCl）原位灌注右肺之前夾住左肺支氣管三次，收集回收的液體。使用Bürker血細胞計數器計數總細胞，并將支氣管肺泡灌洗（BAL）流體離心（1000g，10分鐘）。通過分光光度監測丙酮酸鹽的還原在上清液中測定乳酸脫氫酶，將剩余的上清液冷凍（-80℃）直至進一步分析。對于白細胞亞群的細胞計數，將250μl重懸浮的顆粒（100,000細胞/ ml）旋轉（300g，6分鐘）到顯微鏡載玻片上，空氣干燥。對于每個樣品，對200個細胞計數巨噬細胞和嗜中性粒細胞的數目。在冷凍上清液解凍后，使用Bio-Rad蛋白質測定，根據Bradford方法測定總蛋白質水平。

細胞因子

取出兩片左肺葉，在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃直至進一步分析。在均質化的肺組織中用小鼠炎癥因子7測量炎性細胞因子（白介素-1β（IL-1β），IL-12p70，IFN-γ，IL-6，角質形成細胞化學引誘物（KC），IL-10和TNF- -Plex Ultra-Sensitive Kit。

金屬濃度

通過ICP-MS在另一肺片，腎，脾，肝和心臟中測量Ti，Ag和Si濃度。將1毫升硝酸（HNO 3）60％ultrapur加入?30mg組織或3-4mg涂料顆粒中，并在140℃下加熱5小時。zui后，將樣品在Milli-Q水中稀釋至10ml，并通過ICP-MS（Agilent 7700x ICP-MS）測量Ti，Ag和Si濃度。使用Ge和Rh作為內標，測量元素為47Ti，107Ag和28Si。溶液中的定量限為0.15μg/ l（Ag和Ti）或15μg/ l（Si）。

系統性炎癥（血液參數）

從眶后叢收集血液。在Cell-Dyn 3500R計數器（Abbott，Diegem，Belgium）上進行血細胞計數和差異。將全血離心（14,000g，10分鐘）后獲得的血漿樣品儲存在-80℃直至進一步分析。使用Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kit在血漿中測量炎性細胞因子（IL-1β，IL-12p70，IFN-γ，IL-6，KC，IL-10和TNF- Gaithersburg）。

數據分析

所有數據表示為平均值和標準偏差（SD）。使用非參數Kruskal-Wallis檢驗，隨后通過Dunn多重比較檢驗（分析所有數據。 p <0.05的水平被認為是顯著的。